MIKROBIOLOGI UNTUK TEHNISI KESEHATAN: Identifikasi Basil Gram Negatif

Selasa, 24 Agustus 2010

Identifikasi Basil Gram Negatif

Identifikasi Basil Gram Negatif

Urea test

Tes urea dapat digunakan dalam identifikasi GNB, terutama mereka yang dari keluarga Enterobacteriaceae.

Prinsip

Jika suatu organisme menghasilkan enzim urease akan mampu merusak urea menjadi amonia dan karbon dioksida.

urea -----urease------ > Amonia + karbon dioksida

Amonia akan meningkatkan pH media menjadi 8,0 atau lebih tinggi. Media mengandung fenol merah sebagai indikator pH. Pada pH 8,0 atau lebih tinggi, indikator menjadi berwarna pink cerah. Jika urea dipecah menjadi amonia dan karbon dioksida perubahan pH akan menyebabkan media berubah menjadi berwarna pink cerah dan tes dinyatakan urease.positif

Urease Test

Tujuan Tes ini adalah untuk mengetahui apakah suatu organisme dapat memecah urea menjadi ammonia dan karbon dioksida oleh karena adanya enzim urease yang dimiliki organisme tersebut. . Tes menggunakan medium urea Christensen's broth (cair) . Produk ammonia yang dihasilkan menyebabkan pH medium menjadi alkali sehingga menjadi berwarna merah (menggunakan indikator phenol red).

1. Uninoculated medium.(steril)

2. Reaksi Positive reaction: Proteus., Klebsiella (positip lemah, gambar tidak ada)

3. Reaksi Negative reaction: Salmonella. Medium menjadi lebih kuning daripada warna media asli/steril (uninoculated) karena asam yang dihasilkan selama fermentasi glukosa

Prosedur

Organisme yang digunakan

Pseudomonas aeruginosa

E.coli

Proteus vulgaris

1. Bekerja dalam kelompok untuk praktikum laboratorium ini.

2. Media urea broth atau urea agar miringdiinokulasi dengan tiga organisme yang tercantum di

atas. Gunakan teknik aseptik ketika inoculating tabung.

3. Inkubasi selama minimal 18 jam pada 35-37 o C.

4. Periksa adanya perubahan warna. Media menjadi berwarna merah muda yang cerah

dianggap tes positif . Perubahan warna lain dianggap negatif. Buang tabung ke wadah yang disediakan.

5. Mencatat semua hasil pada tabel di bawah ini.

Organisme Hasil Uji Urea

Pseudomonas

aeruginosa

E.coli

Proteus vulgaris

Pertanyaan

1. Apa enzim yang dihasilkan oleh organisme yang dapat memecah urea?

2. Apa yang dimaksud dengan indikator yang digunakan dalam media urea?

3. Mengapa media menjadi merah muda ketika tes positif?

Identifikasi Basil Gram Negatif :

Uji TSI

Media TSI (Triple Sugar Iron) agar memberikan informasi fermentasi mengenai glukosa, pemanfaatan gula laktosa dan sukrosa, dan proses pernapasan anaerobik

Proses pernapasan yang menggunakan belerang sebagai penerima elektron terakhir untuk menghasilkan hidrogen sulfida. Informasi ini berguna dalam identifikasi basil. Gram negatif

Prinsip

TSI Agar mengandung tiga gula: glukosa (0,1%), laktosa (1,0%), dan sukrosa (1,0%). Juga mengandung fenol merah untuk menunjukkan perubahan pH dan ferro sulfate untuk mengetahui produksi H 2 S

Fermentasi gula

Fermentasi adalah sebuah proses anaerobik. Ketika gula difermentasi akan dihasilkan asam sebagai endproduct dan kadang-kadang gas. Indikator Merah fenol dalam suasana asam berubah menjadi kuning dan berwarna merah dalam suasana alkali. Warna Kuning pada media menunjukkan adanya produksi asam dari hasil fermentasi gula

Enzim untuk fermentasi glukosa adalah enzim konstitutif dimana glukosa merupakan pilihan pertama dari suatu organisme untuk difermentasi. Asam yang dihasilkan akan mengubah warna media di dalam tabung menjadi kuning. Beberapa organisme juga memproduksi gas dari fermentasi glukosa. Gas ini dapat terjebak dalam media agar dan dapat mendorong/mengangkat ke atas agar-agar di dalam tabung atau gelembung dalam tabung atau menyebabkan retakan sehingga hal ini bisa menyebabkan gas melepaskan diri dan tidak dapat dideteksi. Jika organisme hanya menggunakan glukosa, dengan cepat glukosa yang tersedia dalam tabung dikatabolisme

Untuk bertahan hidup organisme mulai menggunakan protein dalam media sebagai sumber karbon. Langkah pertama adalah pemanfaatan protein deaminasi (membentuk amonia-basa). Deaminasi adalah proses aerobik dan hanya terjadi pada lereng media. Organisme yang hanya dapat memfermentasi glukosa deaminate protein untuk terus bertahan hidup ditunjukkan reaksi pada bagian lereng media yang kembali menjadi berwarna merah disebabkan produksi alkali dari deaminasi protein..

Organisme yang dapat menggunakan baik sukrosa atau laktosa (atau keduanya) akan mulai menfermentasi gula ini setelah glukosa telah dimetabolisme. Diperlukan induksi Enzim untuk memetabolisme gula ini sehingga adanya sukrosa dan laktosa di media yang diperlukan akan mengaktifkan operon. Asam terus akan diproduksi sebagai hasil dari metabolisme laktosa dan / atau sukrosa dan tabung akan tetap berwarna kuning. Adanya kuantitas gula yang cukup dalam

media mendukung organisme memproduksi banyak asam yang bertahan untuk setidaknya 2-3 hari.

Produksi Hidrogen Sulfida (H 2 S)

Respirasi anaerobik tidak memerlukan oksigen karena suatu garam anorganik dapat bertingak sebagai akseptor elektron terakhir bukan oksigen. Sulfur adalah salah satu akseptor elektron anaerobik yang wajib digunakan oleh beberapa Anaerob fakultatif . Sulfur tersedia di lingkungan dan di media di kedua molekul.organik (asam amino) dan anorganik (sulfat) .

Hidrogen sulfida adalah tidak berwarna, zat volatil. Dalam rangka untuk mendeteksi H2S dalam media, fero sulfat digunakan sebagai indikator. H2S + fero sulfat à besi sulfida (presipitat hitam) Produk H2S adalah hasil sebuah proses anaerobik sehingga endapan hitam akan

muncul hanya di dasar (butt) tabung TSI.

Pelaporan Hasil dan Interpretasi

Ada hitam pada dasar (butt)-àH 2 S pos+,

Warna kuning pada agar à asam-(A)

Tidak ada hitam di dasar (butt)à H 2 S neg -,

Warna merah pada agar à alkaline (Alk)

Produksi Gas à G

Penulisan Laporan: Lereng (slant) /dasar (butt)

Interpretasi

A / A :Glukosa dan sukrosa dan / atau laktosa difermentasi

A / AG :Glukosa difermentasi dengan produksi gas, sukrosa dan / atau laktosa juga difermentasi

Alk / A : Hanya Glukosa difermentasi

Alk / AG : Hanya glukosa yang difermentasi dengan menghasilkan gas

H 2 S + : Dihasilkan Hidrogen sulfida

H 2 S -- : Hidrogen sulfida negatif

Alk/Alk : Tidak ada gula yang difermentasi

Alk / H 2 S: Laktosa dan sukrosa tidak difermentasi, H2S diproduksi dalam jumlah sangat banyak

menyebabkan dasar media (butt) tertutup warna hitam

A / H2S : Laktosa dan / atau sukrosa difermentasi , H2S diproduksi dalam jumlah sangat banyak

menyebabkan dasar media (butt) tertutup warna hitam

Triple Sugar Iron Agar (TSI 1)

Tujuan tes ini adalah untuk mengetahui organisme yang dapat menfermentasi glukosa, sukrosa dan/atau laktosa dengan atau tanpa menghasilkan gas. Juga untuk mengetahui kemampuan organisme dalam menghasilkan hydrogen sulfida dari thiosulfate dalam kondisi asam. Tipe reaksi dapat digunakan untuk membedakan genus dan spesies dari kelompok Enterobacteriaceae

Hasil reaksi ditulis urut sebagai berikut :

slant/butt/gas/hydrogen sulphide

1. Uninoculated medium (media steril)
2. Acid/acid/gas: Klebiella.
3. Acid/acid: Yersinia enteocolitica (18 hours).
4. Acid/acid: Yersinia enteocolitica. Sesudah 48 jam bagian

slant dari media berubah menjadi merah terang disebabkan

karena asam yang dihasilkan oleh bakteri tersebut hanya

sedikit sehingga mengalami oksidasi pada permukaan

media

5. Acid/acid/gas/hydrogen sulphide: Citrobacter.

Citrobacter mungkin juga menghasilkan reaksi mirip

Salmonella, yaitu: Alkaline/acid/gas/hydrogen sulphide, tapi

derajat warna hitamnya sangat sedikit . Gas yang dihasilkan

tidak terlihat pada gambar ini.

6. Acid/acid/hydrogen sulphide: Erysipelothrix rhusiopathiae,

yang hanya menfermentasi laktosa (positif lemah)

Triple Sugar Iron Agar (TSI 2)

Hasil reaksi ditulis urut sebagai berikut :

slant/butt/gas/hydrogen sulphide

1. Uninoculated medium (media steril) = warna orange
2. Alkaline/acid/gas/hydrogen sulphide: Salmonella (18 hours)

Gas terlihat pada dasar tabung
3. Alkaline/acid/gas/hydrogen sulphide: Salmonella (48 hours).

Warna kuning pada butt tertutup oleh warna hitam disebabkan

adanya produksi hydrogen sulphide.
4. Alkaline/acid/gas/hydrogen sulphide: Proteus (18 hours). Gas

yang dihasilkan tidak terlihat pada gambar ini.

5. Alkaline/acid/gas/hydrogen sulphide: Proteus (48 hours).

Triple Sugar Iron Agar (TSI 3)

Fermentasi glukosa itu sendiri akan menunjukkan warna kuning pada dasar (butt) media. Ffermentasi sucrose dan/atau lactosa akan menyebabkan warna kuning pada bagian dasar (butt) dan permukaan miring (slant) dari media
Bakteri yang mengoksidasi glukosa atau tidak sama sekali dan yang hanya tumbuh pada permukaan slant dari media (obligate aerob) sering menghasilkan reaksi alkaline disebabkan karena mereka menggunakan peptone.
Produksi hydrogen sulphide ditandai dengan adanya warna hitam

Hasil reaksi ditulis urut sebagai berikut :slant/butt/gas/hydrogen sulphide

1. Uninoculated medium.(steril)
2. Alkaline/neutral: Pseudomonas fluorescens, merusak gula- gula

dengan cara oksidasi .
3. Alkaline/neutral: Alcaligenes, tidak merusak gula-gula
4. Alkaline/neutral/hydrogen sulphide: Shewanella, tidak merusak gula-gula

Prosedur

Organisme yang digunakan

Pseudomonas aeruginosa

E.coli

Proteus vulgaris

1. Siswa bekerja dalam kelompok untuk menyelesaikan latihan ini

2. Label sebuah TSI agar miring dengan salah satu organisme yang akan diuji.

3. Semua tes dalam media ini bergantung pada kondisi anaerobik. Jadi organisme haruslah dimasukkan ke dalam media, bukan pada permukaan. Menggunakan jarum inoculating steril , sentuh organisme yang akan diuji dan tusukkan ke dalam media TSI sampai menembus ke bagian bawah tabung. Ketika mengeluarkan jarum, streakkan pada lereng TSI

4. Inkubasi semua tabung selama sekurangnya 18 jam 35-37 o C.

5. Setelah inkubasi periksa tabung untuk melihat perubahan warna. Catat semua hasil pada

tabel di bawah ini.

6. Ketika selesai memeriksa tabung, buang di tempat yang disediakan.

Hasil Pemeriksaan

Organisme Fermentasi Produksi H 2 S

Pseudomonas aeruginosa

E.coli

Proteus vulgaris

Review Pertanyaan

Mengapa media ditusukkan ketika inoculating itu?

Mengapa slant berubah menjadi merah jika hanya glukosa difermentasi?

Yang mana organisme penghasil gas? Bagaimana kau bisa tahu?

Yang mana organisme penghasil H 2 S? Bagaimana kau bisa tahu?

Apa interpretasi hasil untuk Pseudomonas aeruginosa?

Apa interpretasi hasil untuk E. coli?

Apa interpretasi hasil untuk Proteus vulgaris?

Apakah hasil fermentasi TSI sesuai dengan hasil oksidase?

Identifikasi Basil Gram Negatif

Uji Motilitas

Procaryotic sel (bakteri) memiliki untai tunggal protein untuk flagela. Flagela adalah satu-satunya organel dalam sel procaryotic untuk motilitas Pergerakan pada bakteri menunjukkan bahwa organisme memiliki flagella. Sel Eucaryotic dapat bergerak dengan menggunakan flagela, silia, atau pseudopods.

Prinsip

Flagela bakteri mungkin tercat dengan menggunakan pewarnaan khusus untuk flagellar

Prosedur ini agak membosankan. Cara Alternatif untuk menunjukkan bakteri yang mempunyai flagela adalah dengan menunjukkan kemampuan mereka untuk bergerak. Satu-satunya organel untuk motilitas pada bakteri adalah flagela, pergerakan menunjukkan adanya flagela. Media yang berisi konsentrasi agar setengah dari biasanya sehingga menjadi semi - padat. Konsistensi agar demikian tidak bisa dimiringkan karena terlalu lembek, namun memiliki keuntungan bisa digunakan untuk menunjukkan pergerakan bakteri dimana bakteri yang mempunyai flagella akan berenang dan bergerak menyebar dari pusat inokulasi. . Sel akan didistribusikan sepanjang rute migrasi dan akan menyebabkan media menjadi keruh sehingga jejakpergerakan akan terlihat. Jika garam tetrazolium (triphenyltetrazolium klorida atau TTC) ditambahkan ke medium ini, pertumbuhan bakteri di media akan jauh lebih mudah untuk dilihat. TTC adalah tidak berwarna dan larut dalam bentuk teroksidasi, namun menjadi tidak larut dan berubah menjadi merah pada saat ter-reduksi. Setiap proses metabolisme melibatkan oksidasi molekul untuk menghasilkan energi, pewarna TTC akan berkurang (direduksi) seiring dengan pertumbuhan mikroba dan aktivitas mikroba lain, seperti motility. Ketika TTC ditambahkan ke dalam media, jejak kabut yang ditinggalkan oleh bakteri yang bergerak terlihat seperti kabut dan berwarna. Media agar Semi-padat merupakan teknik yang paling umum untuk uji motilitas di laboratorium mikrobiologi klinik.

Motilitas juga dapat dibuktikan dengan menggunakan metode tetes gantung. Setetes suspensi yang mengandung bakteri dibiarkan tergantung pada sebuah penutup (cover-slip) dan diletakkan diatas obyek glass cekung. Slide kemudian diperiksa untuk melihat apakah pergerakan langsung dari organisme. Dianggap bergerak/motil, jika sel bakteri berpindah sepanjang jarak 2-3 kali panjang sel. Jangan dikelirukan dengan gerakan Brownian, karena sel bakteri yang tidak mempunyai flagella atau non motil dapat melakukan gerakan ini sehingga berpindah tempat. Hal ini disebabkan adanya ledakan molekuler dari sel dan bukan karena adanya flagela.

Motility Test

Tujuan Tes ini adalah untuk mengetahui pergerakan (motil) organisme pada suhu yang dikehendaki . Menggunakan medium semi solid. Bakteri motil akan bermigrasi dari area penusukan dan menyebar ke dalam media menyebabkan kekeruhan. Bakteri non motil menunjukkan pertumbuhan pada daerah penusukan, dengan batas pertumbuhan yang jelas, tidak menyebar dan tidak menghasilkan kekeruhan.

1. Uninoculated medium.(steril)

2. Motile: Shewanella. Tumbuh menyebar menghasilkan kekeruhan disekitar penusukan sampai kira-kira 1,5 cm dari dasar tabung.

3. Non-motile: Acinetobacter.

4. Non-motile: Klebsiella. Dalam beberapa kasus bakteri Klebsiella dapat menghasilkan banyak gelembung gas di sekitar area penusukan Menyebabkan pola pertumbuhan yang mirip pohon pinus. Fenomena ini tidak terlihat pada gambar.

Prosedur

Organisme yang digunakan

E.coli

Klebsiella pneumoniae

Enterobacter cloacae

1. Siswa bekerja dalam kelompok untuk menyelesaikan latihan ini.

2. Siapkan tabung berisi media semi-padat. Gunakan jarum steril untuk inokulasi dengan cara

menusuk ke dalam media semi solid hingga setengah bagian.

3. Inkubasi selama minimal 18 jam pada 35 o C.

4. Setelah inkubasi, periksa garis penusukan. Jika terlihat garis tajam berarti organisme tidak bergerak (non motil) . Jika garis itu kabur, menunjukkan pertumbuhan berkabut atau tidak jelas di sekitarnya , maka berarti dengan cara apapun organisme itu mampu bergerak menjauh dari garis penusukan atau berpindah tempat. .

5. Catat semua hasil dalam tabel di bawah ini. Buang semua tabung di tempat yang disediakan.

6. OPTIONAL: Jika memungkinkan, amati juga pergerakan dengan metode teknik tetes gantung

Organisme Hasil

E.coli

Klebsiella pneumoniae

Enterobacter cloacae

Review Pertanyaan

Apa gerakan Brownian? Apakah juga dikatakan motil?

Apa nama organel yang dimiliki bakteri untuk melakukan motilitas ?

Sebut tiga metode yang dapat digunakan untuk menunjukkan flagella pada bakteri.

Identifikasi Basil Gram Negatif

Uji IMViC

IMViC adalah singkatan untuk memudahkan dalam mengingat empat tes biokimia yang digunakan: Indole, Metil merah, Voges-Proskauer, dan Citrate. Keempat tes tersebut membantu dalam memisahkan anggota keluarga Enterobacteriaceae menjadi dua kelompok utama yaitu kelompok E. coli- dan Enterobacter, serta kelompok Klebsiella.

Indole

Prinsip

Organisme yang memiliki enzim tryptophanase dapat menghancurkan asam amino triptofan menjadi gugusan indol . Ketika indole bereaksi dengan para-dimetil - aminobenzaldehye (Kovac's reagen) akan menghasilkan kompleks yang berwarna merah muda Triptofan adalah yang paling banyak dalam media. Pertumbuhan pada agar darah atau coklat agar dapat menghasilkan efek terbaik.

Indole Test

Tes ini digunakan untuk mengetahui apakah suatu organisme dapat menghasilkan gugus indol dari tryptophan atau peptone. Sesudah inkubasi mikroorganisme dalam media tryptophan atau peptone broth, tambahkan reagen Kovac.

1. Uninoculated medium.(steril)

2. Reaksi Positive : Escherichia coli.

3. Reaksi Negative : Salmonella.

Merah metil

Prinsip

Beberapa organisme menghasilkan asam dari metabolisme glukosa dalam jumlah yang cukup untuk menghasilkan pH 4,4 dalam media. Asam ini tidak dimetabolisme lebih lanjut dan dikatakan sebagai asam stabil . Pada pH 4,4 atau kurang pH indikator metil red berwarna merah ceri.

Methyl Red Test

Tes ini digunakan untuk mengetahui apakah suatu organisme dapat menghasilkan dan mempertahankan asam dalam suatu medium yang mengandung buffer. Ini adalah sebuah uji kuantitatif untuk mengetahui jumlah asam yang dihasilkan dari fermentasi karbohidrat. Biakkan dalam media Clark and Lubb's diinkubasi pada kondisi yang sesuai. Separoh dari biakan media ini kemudian digunakan untuk uji Methyl red, dan separoh sisanya untuk uji Voges-Proskauer.

Indikator Methyl red ditambahkan ke dalam biakan :

1. Uninoculated medium.(steril)

2. Reaksi Positive : Salmonella., E. coli

3. Reaksi Negative : Klebsiella.

Voges-Proskauer

Prinsip

Beberapa organisme awalnya menghasilkan asam dari metabolisme glukosa, tetapi lebih lanjut akan dimetabolisme menjadi asam netral sebagai produk akhir, seperti acetoin, dan 2,3-butanediol. Awalnya mungkin penurunan pH menjadi 4,4 tapi produk akhir menyebabkan meningkatnya pH dan uji metil red menjadi negatif. Acetoin dan 2,3-butanediol di bawah kondisi alkali akan bereaksi dengan alfa-naphthol (1-naphthol) untuk menghasilkan warna merah mahoni.

Voges-Proskauer Test

Tujuan Tes ini adalah untuk mengetahui apakah organisme dapat menghasilkan acetylmethylcarbinol (acetoin) dari fermentasi glukosa Biakan organisme dalam media Clark and Lubb's diinkubasi pada kondisi yang sesuai. Biakkan dalam media Clark and Lubb's diinkubasi pada kondisi yang sesuai. Separoh dari biakan media ini kemudian digunakan untuk uji Methyl red, dan separoh sisanya untuk uji Voges-Proskauer . Alpha-naphtol (5%) dan potassium hydroxide (40%) ditambahkan ke dalam medium. Jika acetoin terdapat dalam medium akan menghasilkan warna merah muda – merah.

1. Uninoculated medium (steril)

2. Reaksi Positive : Klebsiella.

3. Reaksi Negative : Escherichia coli.

Sitrat

Prinsip

Sitrat mengandung karbon. Jika suatu organisme dapat menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon maka sitrat dalam media akan dimetabolisme. Bromthymol biru adalah indikator yang dimasukkan ke dalam media . Dalam kondisi basa indikator ini berubah dari hijau ke biru. Metabolisme media sitrat menghasilkan basa ion bikarbonat yang menyebabkan pH media meningkat di atas 7.4.

Simmons citrate

Tujuan Tes ini adalah untuk mengetahui apakah suatu organisme dapat menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dengan menghasilkan suasana . Bromthymol blue digunakan sebagai indicator yang menunjukkan warna biru pada media bila suasana menjadi alkali

1. Uninoculated medium.(steril)

2. Reaksi Positive reaction: Klebsiella.

3. Reaksi Negative reaction: Escherichia coli.

Prosedur

Organisme yang digunakan

E.coli

Klebsiella pneumoniae

Enterobacter cloacae

1. Siswa bekerja dalam kelompok untuk menyelesaikan latihan ini.

2. Teteskan 2 – 3 tetes reagen Kovac’s pada biakan triptofan yang telah diinkubasi 18 24 jam pada

35 C, kocok dan amati adanya cincin indol (lapisan permukaan berwarna merah , tes positip)

Bila tidak ada lapisan gunakan kartu tes indola DrySlide indola, Dengan menggunakan loop

steril transfer sel dari sebuah plate agar atau slant ke area tes pada kartu. Perhatikan

terbentuknya warna merah muda dalam waktu 30 detik. Catat hasil Anda dalam lembar kerja.

Buang kartu tes di wadah. Biohazard

3. Dengan menggunakan teknik aseptik inolulasikan organisme dalam jumlah cukup banyak ke

dalam tabung kaldu glukosa phosphat MR-VP. Inkubasi selama setidaknya 24 jam 35 o C.

Setelah inkubasi, amati kekeruhan MRVP. Jika kekeruhan tidak terlihat, hasil tes tidak dapat

diandalkan. Mungkin tabung perlu diinkubasi kembali sampai pertumbuhan jelas. Dengan

menggunakan pipet steril, ambil biakan kaldu keruh (pertumbuhan positip) masukkan 3 tetes ke

dalam tabung steril untuk uji. Metil Red , kemudian tambahkan 1-2 tetes reagen merah metil

Amati segera adanya warna merah ceri yang menunjukkan tes positif. Warna Oranye atau

kuning dianggap negatif. Catat hasil Anda dalam tabel yang disediakan

Uji Voges-Proskauer : Pada biakan glukosa phosphat yang tersisa tambahkan 2 tetes alfa –

naphthol dan 1 tetes kalium hidroksida (KOH). Perhatikan adanya warna merah mahoni (Tes

VP Positif). Terbentuknya warna membutuhkan waktu 20 menit atau lebih. Sangatlah berhati-

hati dengan KOH. kaustik ini karena dapat menyebabkan luka bakar jika terkena kulit Anda.

. Catat hasil Anda dalam tabel yang disediakan

Buang MRVP dan semua tabung dalam wadah yang disediakan.

4. Inokulasi organisme secara aseptik pada bagian lereng media sitrat agar slant. dan inkubasi

selama sedikitnya 24 jam di 35 o C. Amati citrate, lihat adanya perubahan dari hijau ke biru.

Biru dianggap positif untuk tes ini. Catat hasil Anda dalam tabel yang disediakan

Buang semua rabung di tempat yang telah disediakan.

Organisme Indole Merah metil Voges - Proskauer Sitrat

E.coli

Enterobacter cloacae

Klebsiella pneumoniae

Review Pertanyaan

Apa pola IMViC untuk kelompok E. coli ?

Apa pola IMViC untuk kelompok Enterobacter dan kelompok Klebsiella ?

Apa perbedaan antara reagen dan indikator?

Lengkapi tabel berikut.

Substrat Tes Hasil Positif

Indole Metil Merah Voges - Proskauer Sitrat

Reagen

Indikator

Apakah mungkin suatu organisme memberikan hasil posirif untuk uji Metil merah dan Voges-Proskauer ? Jelaskan jawaban Anda.

Apa yang akan terjadi jika tes MRVP dibaca terlalu cepat?

Uji Kepekaan Metode Difusi Disc

Ketika sebuah cakram kertas filter yang mengandung antibiotika ditempatkan pada agar, obat akan berdifusi dari disk ke dalam media agar. Difusi ini akan menempatkan obat dalam agar hanya di sekitar disk. Sifat Kelarutan kimia dan ukuran molekul akan menentukan ukuran bidang infiltrasi obat di sekitar disc. Jika suatu organisme diinokulasikan pada agar, maka tidak akan terjadi pertumbuhan di daerah sekitar cakram bila rentan.peka/sensitive terhadap obat. Daerah dimana tidak ada pertumbuhan sekitar cakram/disc dikenal sebagai "zona inhibisi".

Prinsip

Antiseptik, desinfektan dan antibiotik digunakan dalam cara yang berbeda untuk

menghambat pertumbuhan mikroba. Antiseptik yang digunakan pada jaringan hidup untuk membunuh Patogen, sedangkan Disinfektan yang mempunyai fungsi serupa dengan antiseptik digunakan pada benda mati.

Antibiotik adalah zat yang dihasilkan oleh organisme hidup, seperti Penicillium atau Basil, yang mana mampu membunuh atau menghambat pertumbuhan organisme lain, terutama bakteri.

Banyak antibiotik secara kimiawi telah diubah untuk mengurangi toksisitas, meningkatkan daya larut, atau memberi mereka beberapa karakteristik lain yang diinginkan karena dalam bentuk alami antibiotik terdapat beberapa kekurangan. Bahan lain telah dikembangkan dari tanaman atau pewarna dan digunakan seperti antibiotik. Istilah yang lebih baik untuk zat-zat ini adalah antimikroba, tetapi istilah antibiotik secara luas digunakan untuk menyebut semua jenis kemoterapi antimikroba.

Banyak kondisi yang dapat mempengaruhi uji kepekaan metode difusi. Saat melakukan tes ini hal-hal tertentu harus tetap konstan dan hanya ukuran zona inhibisi yang boleh variabel. Kondisi yang harus terus-menerus dipertahankan konstan/standard untuk tes adalah konsentrasi agar-agar yang digunakan, jumlah organisme yang digunakan, konsentrasi kimia/obat yang digunakan, dan kondisi inkubasi (waktu, suhu, dan suasana).

Jumlah organisme yang digunakan harus standar sesuai dengan standar kekeruhan McFarland 0,5. atau kekeruhan dapat ditentukan dengan menggunakan spektrofotometer (optik kepadatan 1,0 pada 600 nm).

Untuk menguji kerentanan antibiotik konsentrasi antibiotik telah ditetapkan dan tersedia secara komersial. Setiap metode pengujian telah ditentukan media yang akan digunakan dan inkubasi adalah 35-37 o C dalam udara ambien untuk 18-24 jam.

Metode untuk menguji kerentanan antibiotik Difusi cakram adalah Metode Kirby - Bauer. Media Agar yang digunakan adalah Meuller-Hinton agar yang telah diuji secara ketat untuk komposisi dan pH. Lebih lanjut ketebalan media agar dalam plate adalah faktor yang harus diperhatikan dalam metode difusi disk. Metode ini telah didokumentasikan dengan baik dan standar zona inhibisi telah ditentukan untuk nilai rentan/peka/sensitive dan tahan/resisten. Telah ditentukan juga zona antara (intermediate) yang menunjukkan bahwa terjadi inhibisi, meskipun dalam menggunakan antimikroba ini untuk membasmi organisme dalam tubuh (in vivo). mungkin tidak memadai

Metode standar untuk pengujian antiseptik dan desinfektan lebih ketat dan lebih sulit untuk mahasiswa dalam praktek laboratorium . Ada dua metode tes yang digunakan secara umum :

Tes Koefisien Fenol (perbandingan efek kimia dan fenol pada beberapa organisme)
Test Penggunaan Pengenceran (menguji kimia/obat di bawah kondisi yang sebenarnya digunakan). Uji difusi disk dapat digunakan untuk Test perkiraan penggunaan pengenceran Uji Kimia dalam metode ini menggunakan kertas filter disc jenuh. Disc ini kemudian digunakan untuk memperkenalkan bahan kimia untuk pengujian kerentanan pada media agar. Zona ukuran yang sebenarnya belum standar seperti dalam Metode Kirby-Bauer, tapi ukuran perbandingan zona kimia yang sama antara organisme akan memberikan perkiraan efektivitas kimia.

Prosedur

Uji Kerentanan Antimicrobial metode Kirby-Bauer

Organisme yang akan diuji:

Staphylococcus aureus

E.coli

Prosedur

1. Siswa akan bekerja secara independen di laboratorium

2. Menyiapkan biakan salah satu organisme yang akan diuji pada media agar plate

3. Menggunakan loop steril, membuat suspensi dari sebuah koloni yang tumbuh dalam larutan

salin steril

Campur secara menyeluruh, pastikan bahwa tidak ada bahan padat dari koloni yang masih

terlihat.

4. Ulangi prosedur ini sampai kekeruhan dari larutan garam cocok dengan standar yang tersedia di

kelas Anda.

5. Celupkan lidi kapas steril ke dalam kaldu biakan organisme. Tekan lembut lidi kapas pada

bagian dalam tabung untuk menghilangkan kelebihan cairan. Usapkan ke permukaan media

Mueller-Hinton agar plate atau nutrien Agar plate. Untuk mendapatkan pertumbuhan yang

rapat. lakukan pengusapan dalam satu arah, mulai mengusap menuju sudut kanan, kemudian

secara diagonal, akhiri dengan mengusap seluruh tepi melingkar media agar

6. Biarkan plate selama sekitar 5 menit. supaya cairan meresap.

7. Antibiotik disk dapat ditempatkan pada permukaan agar menggunakan disck dispenser yang

membagi-bagikan multi-disk secara bersamaan pada jarak yang tepat terpisah, atau ambil tiap

disk menggunakan pinset/forsep yang telah disterilkan dengan api dan tempatkan di

permukaan agar.

a. Metode Dispenser

1. Siapkan dispenser berisi disk antibiotik yang sesuai untuk organisme yang Anda gunakan.

2. Tempatkan dispenser di atas permukaan media dan gunakan tuas untuk mengeluarkan disk.

3. Gunakan forseps steril atau ose, dengan lembut tekan disk ke permukaan agar-agar, berhati-

hatilah untuk tidak menekan mereka masuk ke dalam agar-agar.

b. Metode Dispensing individu disk:

1. Siapkan 6 macam single disk yang sesuai .

2. Menggunakan tuas, keluarkan disk dan tempatkan terpisah pada jarak yang sama pada

permukaan agar.

3. Gunakan forseps atau loop steril untuk menekan disk dengan lembut ke permukaan agar.

4. 6 disk juga dapat secara individual ditempatkan ke permukaan agar menggunakan forsep steril.

8. Tutup plate dan inkubasi selama 24 jam pada 37 ° C.

9. Gunakan penggaris metrik untuk mengukur diameter zona inhibisi (jika ada) pada setiap

antibiotik yang digunakan.

10.Bandingkan pengukuran yang diperoleh dari masing-masing antibiotik dengan tabel standar

untuk menentukan apakah spesies bakteri yang diuji adalah resisten atau sensitif terhadap

antibiotik.

11. Gunakan data yang Anda kumpulkan untuk mengisi tabel di bawah. Buang plate dalam

wadah Biohazard.

Antibiotik Staph. aureus E.coli

Zona Diameter (mm) Interpretasi Chart

Antibiotik Resistant Intermediate Sensitif

Tetracycline = 14 15-18 = 19

Ciprofloxacin = 15 16-20 = 21

Enoxacin = 14 15-17 = 18

Erythromycin = 13 14-22 = 23

Penisilin

Staphylococci = 28 = 29

Oxacillin

Staphylococci = 10 11-12 = 13

Tobramisin = 12 13-14 = 15

Ceftriaxone = 13 14-20 = 21

Kanamycin = 13 14-17 = 18

Klindamisin = 14 15-20 = 21

Piperacillin

Gram negatif = 17 18-20 = 21

Ampicillin

Gram negatif enterics = 28 = 29

Staphylococci = 13 14-16 = 17

Tes Kepekaan Antiseptik / Disinfektan

Organisme yang digunakan

Staphylococcus aureus

E.coli

Bacillus cereus

Pseudomonas aeruginosa

1. Siswa bekerja secara individu di laboratorium .

2. Siapkan satu dari organisme yang akan diuji, 5 media nutrien agar plate, dan Lidi kapas steril.

3. Celupkan lidi kapas ke dalam kaldu berisi biakan organisme. Tekan lembut kapas pada bagian

dalam tabung untuk menghilangkan kelebihan cairan. Usapkan / streak ke permukaan nutrien

agar plate. Supaya dapat menghasilkan pertumbuhan yang rapat, usap dalam satu arah.

Pertama usap menuju sudut kanan media, lalu usapkan secara diagonal, terakhir usapkan

melingkari tepi media. Ulangi prosedur terhadap plate yang lain..

4. Tempatkan disc yang telah direndam dalam antiseptik atau desinfektan di tengah masing-masing

plate. Pastikan memberi label plate dengan organisme dan zat kimia yang digunakan.

5. Inkubasi plate dalam posisi terbalik

6. Mengukur diameter zona inhibisi untuk setiap bahan kimia. Isikan hasil pengukuran pada tabel

yang tersedia.

7. Membuang piring dalam wadah Biohazard.

Kimia Staph. aureus E.coli Basil cereus Ps. aeruginosa

Review Pertanyaan

Kondisi apa yang harus dipertahankan terus-menerus ketika melakukan prosedur difusi disk?

Definisikan :

Antiseptik

Disinfektan

Antibiotik

Zona inhibisi

Menurut hasil Anda, yang merupakan bahan kimia yang paling efektif?Apa dasar kesimpulanmu?

Apa tes standar yang digunakan untuk menentukan efektivitas antiseptik dan disinfektan?

Apa yang dimaksud dengan metode standar yang digunakan untuk menguji kerentanan antimikroba?

Pedoman Identifikasi Organisme Yang Tidak Diketahui

Organisme yang tidak diketahui akan tumbuh pada media yang mengandung 5% darah domba atau Nutrient agar. Inokulasi spesimen yang mengandung organisme ke permukaan media agar plate dengan cara streak untuk mendapatkan koloni terpisah/terisolasi. Setiap plate mewakili biakan murni. Setiap mahasiswa bertanggung jawab untuk melakukan pekerjaan mereka sendiri, tetapi boleh meminta siswa lain untuk pendapat, nasihat, atau petunjuk tentang apa yang harus dilakukan.

Instruktu Lab dapat memberikan bantuan pada semua kecuali dua yang terakhir.

Siswa diperbolehkan untuk merujuk ke catatan kelas, teks, dan sumber informasi lain.

Formulir Laporan Identifikasi Organisme yang Tidak Diketahui akan disediakan untuk masing-masing siswa. Formulir ini harus diisi dengan rapi dan ditulis menggunakan tinta biru atau hitam. Ejaan harus benar dan semua notasi test harus sesuai. Laporan ini harus diperlakukan seolah-olah adalah bagian dari bagan pasien. Tidak diperbolehkan Menghapus, men-typex, dan menghilangkan semua informasi yang dicatat pada formulir. Setiap terjadi kesalahan mahasiswa harus membuat satu catatan mulai jenis kesalahan , tanggal, dan melaporkan hasil kesalahan yang sudah dikoreksi.

Langkah-langkah Untuk mengidentifikasi Organisme yang tidak diketahui

• Pewarnaan Gram

• Morfologi Koloni

• Pengujian Biokimia

Tes biokimia hanya diperlukan untuk identifikasi organisme yang tepat. Tes yang tidak perlu akan menghasilkan pengurangan poin. Tes harus dipesan ke instruktur laboratorium dengan menggunakan formulir yang disediakan.. Formulir ini juga harus diisi lengkap. Form pemesanan digunakan terpisah untuk uji yang akan dilakukan. Boleh menggunakan lebih dari satu form pemesanan . Kegagalan akan menghasilkan kehilangan poin dari nilai akhir.

Pewarnaan Gram adalah titik awal pengujian yang akan memberikan siswa suatu ide umum mengenai identitas organisme yang tidak diketahui.Hanya tes yang berguna untuk identifikasi organisme yang dicurigailah yang harus dilakukan.

Hasil tes harus dilaporkan secara tepat. Kegagalan untuk melakukan hal ini dapat mengakibatkan seorang Siswa kehilangan poin dari nilai akhir. Kebanyakan hasilnya dapat dilaporkan dengan Pos+ atau Neg-.

Suatu penjelasan rinci tentang hasil ini tidak diperlukan. Identitas organisme yang dicari harus ditulis dengan benar. Huruf awal nama Genus harus ditulis dengan huruf besar sedangkan nama spesies ditulis dengan huruf kecil. Jika terbiasa menulis dengan huruf besar semua, pastikan untuk membedakan huruf pertama dari nama genus harus lebih besar daripada yang lain. Kesalahan dalam menuliskannya akan menyebabkan hilangnya poin.

Di bawah ini adalah contoh formulir permintaan pengujian.

Harus diisi dengan sebenar-benarnya dan sesuai dengan tes yang dilakukan. Formulir ini akan disimpan oleh Instruktur Laboratorium dan disatukan dengan Formulir Laporan Identifikasi terhadap Organisme yang Tidak Dikenal Hal ini untuk dipertimbangkan dalam penilaian.