Kultur dan Teknik Isolasi

Kultur dan Teknik Isolasi

Boedhy Rahardjo, Lab. Bakteriologi DIII Analis Medis-FK UNAIR

Pendahuluan

Mikroorganisme harus memiliki suplai gizi konstan jika mereka ingin bertahan hidup.

Organisme yang hidup bebas memperoleh nutrisi dari lingkungan sedangkan organisme parasit memperoleh nutrisi dari tuan rumah mereka. Ketika kita mencoba untuk menumbuhkan mikroba di laboratorium harus disediakan gizi yang memadai dalam media buatan. Mungkin media cair (kaldu) atau padat (agar). Gizi yang dikehendaki dapat dimasukkan ke dalam kaldu atau media agar  (ekstrak dari rumput laut) yang meleleh pada 100 o C dan membeku di sekitar 42 o C. Kebanyakan bakteri patogen lebih suka tumbuh pada 37 o C sehingga agar memungkinkan untuk digunakan sebagai media padat pada suhu inkubator.   Agar tetap padat hingga mencapai 100 o C, media padat masih bisa digunakan untuk Bakteri thermophiles   yang lebih suka tumbuh pada suhu diatas 50 o C . Bila Organisme ditumbuhkan  dalam media kaldu akan menimbulkan kekeruhan, atau tampak seperti kabut dalam kaldu. Pada media agar, massa sel, yang dikenal sebagai koloni, muncul setelah masa inkubasi. Teknik-teknik tertentu akan memungkinkan sel-sel bakteri tumbuh secara terpisah pada media agar   sehingga   koloni akan dapat dipisahkan dari koloni lain dan dapat dipelajari karakteristik pertumbuhannya.   Koloni berasal dari satu sel bakteri, semua sel dalam satu koloni berasal dari spesies yang sama. Koloni yang Terisolasi/terpisah   diasumsikan sebagai kultur murni   

Prinsip

Kultur atau biakan campuran mengandung dua atau lebih spesies bakteri   dan dapat dengan mudah dipisahkan berdasarkan karakteristik koloni atau dengan uji biokimia.  .  

Secara berkala organisme harus dipindahkan ke media segar supaya bisa terus hidup. Teknik Kultur   tidak hanya menyediakan organisme    tetapi juga memungkinkan untuk pemisahan sel-sel bakteri untuk mendapatkan koloni terisolasi. Prosedur kultur ini dikenal sebagai teknik isolasi.

Streak pada lempeng agar   memungkinkan untuk pertumbuhan koloni terisolasi pada permukaan agar. Koloni terisolasi adalah koloni yang tidak menyentuh koloni lainnya dan lainnya diasumsikan sebagai kultur murni

Koloni ini dapat diakses dengan mudah untuk melakukan pewarnaan dan Identifikasi.   Morfologi koloni  sangat berguna dalam mengidentifikasi organisme.   Saat organisme dapat tumbuh secara berbeda pada berbagai media, jenis media yang digunakan harus dimasukkan sebagai bagian dari morfologi kolonial. Unsur-unsur lain deskripsi kolonial koloni meliputi warna, hemolisis (jika ditanam di agar darah), bentuk, elevasi dan margin.    

Bentuk mengacu pada penampilan keseluruhan koloni. Elevasi adalah ketinggian yang  dicapai koloni   pada permukaan agar.  Tepi koloni disebut sebagai margin.

Prosedur Transfer Secara Aseptis  

Berikut sebuah panduan untuk mencegah terjadinya kontaminasi    organisme yang berasal dari   lingkungan 

TRANSFER  PLATE-to-TUBE 

 Perhatikan gambar secara seksama :

1. Sterilisasi loop dengan api bunzen sampai merah membara
2. Dinginkan loop dengan tanpa menyentuh apapun (termasuk menyentuh pada tepi media agar plate), ambil koloni bakteri yang terisolasi.
3. Inokulasikan kedalam media dalam tabung.

Perhatikan posisi tangan dalam memegang loop, membuka plate / tutup tabung.

Sterilkan kembali loop setelah digunakan.

TRANSFER   TUBE-to-TUBE  

    

Inoculating loop disterilkan di api sampai  kawat   merah-membara.  .

Tabung ( dua tabung) dipegang dalam posisi miring dan tutup ditarik keluar (seperti yang ditunjukkan) dengan tangan yang memegang inoculating loop.

Lewatkan mulut tabung di atas api secara singkat. Celupkan loop steril pada biakan  dalam media tabung dan transfer inokulum ke tabung lain berisi kaldu/media

Loop   yang mengandung organisme harus disterilkan kembali sebelum disimpan. 

Lewatkan mulut di atas api  dan pasang kembali tutup tabung 

STREAK-PLATE 

Metode  streak pada media plate   merupakan teknik sederhana   dalam menebar sel-sel di atas permukaan media. Tujuan utama adalah untuk mendapatkan koloni yang terisolasi dengan baik         sehingga dapat diperoleh suatu biakan murni dari masing-masing spesies dalam suatu specimen atau biakan campuran. Meskipun teknik tampak sederhana namun sangat diperlukan keahlian   dari ahli bakteriologi.

Inoculating loop adalah perangkat yang digunakan untuk melakukan streak. Periksa kawat loop, gunakan loop yang sudah dikalibrasi.

Siapkan   specimen / suspensi sel     Sterilkan loop (Setelah   kawat loop merah membara,  biarkan sampai dingin tanpa menyentuh apa pun),  lemudian celupkan loop dalam specimen/biakan campuran. 

Keberhasilan dalam memperoleh koloni terisolasi adalah tergantung dari jumlah dan kepadatan inokulum  dan teknik streak.  Prosedur menjadi lebih merupakan seni daripada sains, dan konsisten keberhasilan dicapai dengan latihan. Dua pola dasar diilustrasikan pada gambar di atas. Pola tiga tahap streak   dianjurkan bagi pemula, karena kemungkinan besar akan memberikan hasil yang memuaskan dengan suspensi yang memiliki beragam kepadatan mikroba  .

Buka tutup atas hanya cukup untuk memungkinkan masuknya loop dari kanan (dari arah yang berlawanan jika Anda kidal). Lihat gambar  pola streak di atas. Dengan gerakan pergelangan tangan,   goreskan loop bolak-balik di atas permukaan medium, mulai dari yang paling kiri (dari arah yang berlawanan jika Anda kidal) dan bergerak menuju pusat plate.   Goreskan dengan tekanan sangat lembut. Setiap ayunan Loop harus serapat mungkin   ketika bergerak di permukaan medium. Dalam pola streak multiphase, loop disterilkan setelah tahap pertama selesai, didinginkan, dan (plate diputar  ke 90 ° )    streak lagi dari tepi kiri menuju pusat  dengan menyentuhkan beberapa kali di atas goresan/streak tahap pertama (Jangan memasukkan/mengambil lagi dari specimen atau biakan campuran). Ini diulang untuk setiap fase-fase berikutnya.   Ganti tutup segera bila Anda sudah selesai men-streak, dan sterilkan loop setelah selesai digunakan.

TEKNIK aseptis untuk menuangkan ke PLATE

 Buka tutup plate secukupnya ,    dalam hal ini tutup dibuka hanya untuk memungkinkan masuknya mulut  botol atau  tabung.

Catatan :

Untuk   semua situasi transfer,  ujung inoculating loop dan jarum harus dibakar sampai merah membara (red hot sterilization) . Perhatikan bahwa penutup cawan petri dibuka hanya cukup untuk memungkinkan masuknya jarum. Selalu ketika inoculating tabung, tutup atau plug diperlakukan seperti ditunjukkan pada gambar dimana jari kelingking membuka dan menahan tutup tabung sementara jari lainnya pada tangan yang sama mengoperasikan loop atau jarum, dan tabung selalu dipegang dalam posisi miring ,   - tidak lurus ke atas atau ke bawah atau berdiri di rak tabung reaksi.

Prosedur Inokulasi dari Biakan Cair

Bahan

Kultur campuran dalam kaldu

Inoculating loop

Bacticinerator

Inkubator

Hara kaldu steril 

Siswa bekerja secara individu.

1. Label media kaldu steril   dengan sumber kultur dan inisial anda.

2.  sterilkan loop.

3.  gunakan teknik aseptik yang tepat, ambil  kultur campuran dari media kaldu dengan  menggunakan loop/ose  .

4. Masukkan loop ke dalam tabung kaldu steril   dan  putar perlahan.  Sterilkan loop.

5. Inkubasi  kaldu pada 37 o C selama 24-48 jam.

6. Perhatikan kekeruhan kaldu  . Catat hasilnya  dalam tabel di bagian akhir prosedur  .

Inoculating Pada Agar Slant

Bahan

Kultur campuran dalam kaldu           

Inoculating loop

Bacticinerator

Inkubator

Media   agar miring steril

Siswa bekerja secara individu.

1. Label media   agar miring steril dengan sumber kultur dan inisial.

2.  sterilkan loop.

3.  gunakan teknik aseptik yang tepat, ambil biakan campuran pada media kaldu dengan  menggunakan loop/ose.  

4. Masukkan loop ke media agar miring steril, mulai dari dasar slant, tarik ke atas dengan membuat lingkaran-lingkaran  

 . Jangan sampai merobek agar.  sterilkan loop.

5. Inkubasi media agar  miring pada 37 o C selama 24-48 jam.

6. Perhatikan kemiringan untuk pertumbuhan. Catat hasil dalam tabel di akhir bagian prosedur.

Streak Plate

Bahan

Kultur campuran dalam kaldu

Inoculating loop

Bacticinerator

Inkubator

Plate agar steril 

Siswa bekerja secara individu.

1. Label media agar plate steril   dengan sumber kultur dan inisial.

2.  sterilkan loop.

3.  gunakan teknik aseptik yang tepat, Dengan menggunakan loop/ose, ambil kuman campuran dari  biakan kaldu  .

4. Angkat tutup plate agar hingga  setengah terbuka. Goreskan ose pada permukaan media agar.  Loop harus sejajar dengan

    permukaan untuk mencegah supaya media agar tidak tercongkel  

5. Tutup kembali plate  ,.  sterilkan loop. Angkat plate agar dan  buat satu lapisan ke bagian plate  yang diinokulasi   .  .

6. Tutup kembali plate  .  sterilkan loop. Angkat plate agar dan  buat satu lapisan  ke dua pada

    bagian plate yang diinokulasi  . Sterilkan loop/ose

7. Tutup kembali plate, inkubasi 37 o C   selama 24-48 jam. Amati pertumbuhan dan  catat hasil

    Anda dalam tabel yang disediakan di akhir bagian prosedur.  

Pour Plate

Bahan

Kultur campuran dalam kaldu

Inoculating loop

Bacticinerator

Inkubator

Nurient Agar Cair

Cawan petri steril

Pipet steril

Siswa bekerja berpasangan.

1. Label bagian bawah piring petri steril dengan sumber kultur dan inisial. Balikkan tutup piring

    sehingga menghadap ke atas.

2. Nutrient agar direbus (100 o C) untuk mencairkan agar. Agar pada temperatur ini akan membunuh bakteri, maka dinginkan agar sampai 60 o C , masukkan dalam bak air untuk menjaga suhu. Demikian ini supaya tidak membunuh bakteri ketika mereka dituangi   cairan agar dan juga akan mengurangi jumlah kondensasi yang akan menempel pada tutup cawan petri.

3. Bekerjalah  dengan cepat, karena   agar akan memadat pada  42 o C.  Masukkan 1 ml kaldu yang berisi biakan campuran ke dalam petridish steril, kemudian tuangi dengan agar cair bersuhu kira-kira 60oC. Tutup Goyangkan Lembut cawan petri dalam angka delapan untuk benar-benar menutupi bagian bawah petri dengan agar.

4. Biarkan agar untuk mrmadat. Tambahkan ke pelabelan jumlah kultur campuran yang digunakan dalam agar. Sebuah mililiter berisi sekitar 20 tetes. Dua tetes   kira-kira 0,1 ml dan 1 tetes akan menjadi sekitar 0,05 ml.

5. Inkubasi pada 37 o C selama 24-48 jam. Periksa petri untuk pertumbuhan dan catat hasilnya dalam tabel di bawah ini.

 Pour plate yang digunakan untuk menghitung organisme dalam suatu larutan. Volume larutan standar  dicampur dalam agar yang dicairkan. Setiap organisme dalam larutan dipisahkan satu sama lain. Ketika agar  membeku, sel  terjebak dalam agar dan berkembang menjadi  koloni. Setiap koloni dapat dihitung dan mewakili satu sel  aslinya dalam larutan. Jika mililiter larutan dicampur dalam agar maka jumlah koloni mewakili jumlah organisme per mililiter larutan. Biasanya sebagian dari mililiter yang dicampur dalam agar-agar sedemikian rupa sehingga jumlah koloni yang dihitung harus dikalikan dengan faktor pengenceran untuk menentukan jumlah organisme dalam mililiter larutan. Apabila   koloni pada agar-agar lebih dari 300 koloni akan sulit dihitung   secara akurat   Sedangkan bila kurang dari 30 koloni pada plate dianggap secara statistik tidak signifikan.    Artinya, plate yang distribusi koloninya berjumlah antara 30 – 300 koloni adalah yang memenuhi syarat untuk dievaluasi/dihitung,  kemudian jumlah dikalikan dengan faktor pengenceran.

 . 

Metode ini digunakan untuk mengevaluasi jumlah organisme dalam susu, air minum, dan bahkan

air di pantai. 

Meskipun sel-sel tumbuh dan terisolasi   satu sama lain dalam media agar plate , mereka tidak akan menghasilkan morfologi koloni  khas   dan tidak mudah diakses untuk pengujian lebih lanjut. 

Review Pertanyaan

Bagaimana Anda bisa tahu pertumbuhan telah terjadi dalam biakan kaldu?

Apa  fungsi ‘agar’ pada media?

Pada suhu berapa agar mencair ?

Pada suhu berapa agar membeku/memadat?

Mengapa agar cair   didinginkan sampai 60 o C sebelum menambahkan organisme?

Sebutkan dua metode untuk mendapatkan koloni terisolasi.

Apa tujuan utama dari   streak plate?

Berapa banyak jenis koloni yang Anda amati di   streak plate?

 Gambarkan jenis setiap koloni diamati dengan menggunakan istilah standar.

Apa tujuan utama dari pour plate?  

Berapa banyak koloni yang Anda amati di   pour plate 0,1 ml?

Berapa banyak koloni yang Anda amati di pour plate 0,05 ml  ?

Mungkinkah menentukan jumlah organisme dalam kultur campuran dari media kaldu?

Faktor pengenceran 0,1 ml adalah 10 dan untuk 0,05 ml faktor pengenceran adalah 20. Apa rumus umum untuk menentukan jumlah organisme dalam suatu larutan dengan menggunakan

sebuah pour plate?

Pengenceran serial   dari susu. Diperoleh Informasi data sebagai berikut :.

Pengenceran                         Jumlah Koloni

1:100                                       312

1:1000                     262

1:10000                     22

Berapa banyak organisme berada dalam mililiter susu yang diuji?