PEWARNAAN BAKTERI

 

 Pewarnaan Endospora bakteri
Uji diferensial untuk mengidentifikasi Bakteri Genus Bacillus  & Clostridium

Pewarnaan endospora B. Subtilis (Spora Green) - Y tambe Wiki

Pewarnaan endospora menggunakan serangkaian pewarna, zat Malachite hijau untuk endospores  dan zat safranin warna pink  untuk sel vegetatif.

Sebelum membahas prosedur untuk pewarnaan endospores, penting untuk mengetahui  sifat endospora  

John Tyndall, orang  Irlandia kelahiran Inggris pada abad ke-17 ,   seorang fisikawan yang membuat banyak kontribusi untuk ilmu pengetahuan, salah satunya adalah penemuan bahwa beberapa mikroba ada dalam dua bentuk:
             1. bentuk tahan panas  (endospores)
             2. bentuk peka panas  (sel-sel hidup vegetatif)

Tyndall menemukan bahwa   butuh pemanasan lama atau bertahap untuk menghancurkan bentuk mikroba yang tahan panas. Hasil dari penelitian ini adalah metode sterilisasi  dengan memanaskan ke titik didih pada 2 - 3 hari berturut-turut ("Tyndallization").

"Tyndallization" berguna untuk sterilisasi media pertumbuhan dan situasi lain di mana otoklaf ( instrumen yang menggunakan panas dan tekanan untuk mensterilkan) tidak tersedia

Apakah endospora itu?

Endospores diproduksi oleh beberapa jenis bakteri  terutama genus Clostridium dan Bacillus.  Struktur pelindung ini dibuat untuk  menanggapi kondisi lingkungan yang ekstrim (seperti suhu tinggi, pengeringan, bahan kimia, perubahan pH dan kekurangan makanan).melalui proses yang dikenal sebagai sporulasi    

Dalam, bentuk menyandang endospora, bakteri tidak dapat memetabolisme atau mereproduksi, tetapi mirip  seperti benih tanaman. Ketika kondisi lingkungan kembali menjadi menguntungkan,   bakteri kembali ke  bentuk aktif (sel vegetatif).
  
Pewarnaan Endospores   bakteri
Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspores, perlu dilakukan pemanasan supaya cat malachite hijau  bisa masuk ke dalam spora , seperti halnya pada pewarnaan  Basil Tahan Asam dimana cat  carbol   fuschsin  harus dipanaskan untuk bisa menembus  lapisan lilin asam mycolic  dari Mycobacterium .
  Skema prosedur pengecatan Spora Schaeffer Fulton

Protokol   pewarnaan diferensial endospores dan sel vegetatif adalah sebagai berikut:

  

- Letakkan slide bakteri di atas bak air yang dipanaskan
- Genangi  slide dengan larutan malachit green  yang sudah disaring, (sebagai pewarna utama), biarkan posisi
   slide tetap di atas bak air panas (seperti dikukus)  selama 5 menit, tambahkan larutan malachit jika  mulai
   mengering.
-  Angkat slide dari bak air dan bilas dengan air sampai tidak ada lagi pewarna yang tinggal.
-  Genangi slide dengan safrinin (counterstain) selama 20 detik dan kemudian bilas.
-  Lihat slide dengan mikroskop cahaya.(pembesaran 1000xTM, menggunakan minyak immersi) 

Hasil Pengamatan :
Endospores akan tampak hijau,  karena mempertahankan warna utama, Malachite hijau . Sel-sel vegetatif   akan terlihat merah muda, karena menyerap safrinin.

Problem Interpretasi  pengecatan endospora  

Perlu dicatat bahwa setiap goresan kecil pada slide juga dapat terlihat hijau. Segala sesuatu  pada slide  yang terlihat hijau belum tentu sebuah endospora. Endospores itu kecil dan biasanya oval.,  adapun  gumpalan hijau besar atau tidak teratur   pada slide dapat dikatakan artefak.

Pewarnaan  Ziehl Neelsen
Uji diferensial untuk Mengidentifikasi Bakteri Mycobacterium dan Nocardia 

Bakteri Tahan Asam (pink) dan bakteri Tidak Tahan Asam (biru)  

Mycobacterium dan Nocardia adalah penyebab  penyakit menular, seperti tuberkulosis, kusta dan infeksi   paru-paru serta kulit.lainnya.  Oleh karena itu, jelas penting untuk dapat mengidentifikasi secara akurat anggota genus ini.

Dinding Sel  mikobakteri dan Nocardia
Bakteri Mycobacterium  dan Nocardia memiliki dinding sel yang tidak biasa , yang licin dan sukar ditembus karena adanya asam mycolic dan sejumlah besar asam lemak, lilin, dan lipid kompleks. Organisme ini sangat tahan terhadap desinfektan, pengeringan dan sulit untuk diwarnai dengan  pewarna berbasis air seperti Gram.

  Pewarnaan Tahan Asam memerlukan teknik pewarnaan khusus yang menggunakan panas untuk menambah daya tembus cat  masuk ke dalam dinding sel lilin bakteri

Membuat preparat (mear) yang akan dicat Tahan Asam.

Smear adalah sampel bakteri tersuspensi dalam jumlah kecil air pada slide. sampel itu kemudian dikeringkan dengan panas. Panas membunuh bakteri dan melekatkan sampel ke slide sehingga tidak mudah terbilas..

Gambar : prosedur pewarnaan tahan asam

Pengecatan BTA Ziehl Neelsen

Maksud         : Cara mengidentifikasi Bakteri Tahan Asam (BTA) menggunakan metode pengecatan    Ziehl 

                         Nielsen  

Tujuan           : Diagnosis

Sampel          : sputum, lesi, Swab, pus, urine, darah, faeces, liquor, pleura, ascites,dll.

Alat                 :

-       Lampu Spirtus/bunzen

-       Obyek glass

-       Rak pengecatan

-       Ose   

-       Pipet pasteur

-       mikroskop

Reagen            :

1.    Carbol fuchsin :

        -   Basic fuchsin                                       3,0 gr

        -   Etanol/methanol                                  100 ml

        -   Kristal phenol                                      45 gr

        -   Aquadest                                             900 ml

2.    larutan dekolorisasi :

        -   HCl pekat                                            30 ml

        -   Etanol                                                  970 ml

3.   Warna pembandung :

        -   Methylen blue khlorida                       30 ml

        -   Air suling/aquadest                             1000 ml

Cara kerja     :

Protokol untuk pewarnaan tahan asam adalah sebagai berikut:

-  Letakkan slide di atas bak air panas
-  Genangi slide dengan carbol fuchsin (pewarna utama)  
-  Biarkan slide di atas bak air yang dipanaskan selama 3 - 5 menit, tambahkan larutan carbol fuchsin jika
    mulai mengering.
-  Angkat slide   dan bilas sampai bersih dan tak ada lagi cat yang terbawa air bilasan.
 - Tuangi slide dengan decolorizer, Asam Alkohol, selama 10 - 15 detik dan kemudian bilas.
 - Tuangi slide dengan counterstain, Metilen blue, selama satu menit dan kemudian bilas.
-  Keringkan slide. Sekarang siap untuk ditampilkan di bawah rmkroskop menggunakan minyak (1000x)          
Interpretasi

  

Sel  Tahan Asam  akan berwarna merah muda, karena menyerap carbol  fuschion    dengan bantuan pemanasan   Sel Non Tahan Asam, (bakteri yang tidak memiliki dinding sel lilin) akan berwarna biru,   s


Referensi :

Bauman, R. (2005) Mikrobiologi.

Pewearnaan Gram

Uji  Identifikasi dan klasifikasi bakteri  Gram-positif dan Gram-negatif

Pengantar

Setelah mikroba diakui sebagai sumber penyakit menular,  iperlukan suatu metode untuk mendeteksi dan mengidentifikasi bentuk-bentuk kehidupan mikroba. Namun mikroba tidak berwarna dan sulit untuk dilihat. 
Pada 1800-an, Kristen Gram, ahli bakteriologi Denmark, telah mengembangkan teknik untuk pewarnaan bakteri yang masih banyak digunakan sampai saat ini yaitu Gram stain. Pewarnaan Gram  penting untuk mengklasifikasikan bakteri ke dalam kelompok Gram positip atau Gram negatip. Dalam pengecatan Gram,  bakteri   disebut Gram-positif  bila berwarna ungu   dan Gram-negatif. bila berwarna pink, Pewarnaan Gram adalah uji diferensial  yang menggunakan dua zat warna untuk membedakan antara dua tipe dasar dinding sel bakteri.

1. Pengecatan Gram

Maksud         :   adalah tata cara laboratorium untuk mengindentifikasi bakteri menggunakan metode  

                           pengecatan Gram.

Tujuan           :   Diagnosis

Sampel          :   Swab, pus, urine, darah faeces, liquor, pleura, ascites, sputum, bahab usapan, sekret,dll.

Alat               :

-       Lampu spiritus/bunzen

-       Pipet Pasteur

-       Obyek Glass

-       Rak pengecatan

-       Ose

-       Mikroskop

Reagen           :

1.    Larutan Gram A (Carbol Gentian Violet) :

          a.    Gentian Violet                                       1 gr

          b.    Alkohol 96%                                      10 ml

          c.    Phenol Kristal                                       1 gr

          d.   Aquadest                                            90 ml

2.    Larutan Gram B (lugol)

         a.    Yodium                                                1 gr

         b.    Kalium Yodida                                     2 gr

         c.    Aquadest                                          300 ml

3.    Larutan gram C (Alkohol 96%)

4.    Larutan Gram D ( Basic fuchsin 1%)

         a.    Basic Fuchsin                                                1 gr

         b.    Aquadest                                                       100 ml

Berikut sedikit paparan bagaimana cara pewarnaan Gram (Modifikasi) dan Interpretasinya, semoga bermanfaat :