Pedoman Praktikum Bakteriologi
Untuk Pendidikan dan Pelatihan Profesi Analis Medis / Analis Kesehatan
Oleh :
Boedhy Rahardjo
Laboratorium Bakteriologi DIII Analis Medis Fak. Kedokteran
Universitas Airlangga Surabaya
Halaman
Daftar Isi
Keselamatan Kerja 2
Peraturan Keamanan Laboratorium Mikrobiologi 3
Review – Quiz 4
Teknik aseptik 5
Mikroskop 7
Smear 10
Pewarnaan 20
Kultur dan Teknik Isolasi 25
Staphylococcus 33
Streptococcus 38
Kultur Usap Tenggorokan 45
Oksidase 48
Urea 50
Triple Sugar Iron Agar (TSI) 52
Motilitas 56
IMViC 58
Disc Kerentanan Metode Difusi 61
Pedoman Identifikasi diketahui 67
Referensi 70
Keselamatan Kerja
Pendahuluan
Adalah sangat penting bahwa siswa mengikuti semua aturan yang ditetapkan oleh instruktur laboratorium, manajer laboratorium, atau asisten lab untuk menjamin keselamatan semua individu dalam kelas. Ketidak-taatan dalam mengikuti aturan-aturan yang telah ditetapkan dapat mengakibatkan pemberhentian siswa dari kelas.
Laboratorium memiliki peralatan keselamatan standar tertentu. Ini biasanya termasuk keperluan umum pemadam kebakaran, obat cuci mata, perlengkapan mandi dan saklar untuk listrik dan outlet gas. Ini adalah tanggung jawab siswa untuk mencari dan mengetahui bagaimana menggunakan peralatan keselamatan umum di laboratorium. Selain itu, siswa harus faham bagaimana cara keluar dari ruangan dalam keadaan darurat, cara memanggil Keamanan Kampus, dan bagaimana untuk memperoleh pertolongan darurat .
Laboratorium mikrobiologi memiliki tambahan beberapa pertimbangan keselamatan. Ketika Siswa/individu bekerja dengan organisme yang potensial patogen harus diperhatikan upaya untuk mencegah kemungkinan terinfeksi atau transmisi organisme dari laboratorium.
Mahasiswa harus memakai pakaian pelindung (jas lab) ketika bekerja di laboratorium.
Jas Lab tidak boleh dipakai di luar laboratorium.
Sarung tangan akan disediakan dan siswa hendaknya memakai sarung tangan jika menangani kultur/biakan .
Permukaan meja laboratorium harus didesinfeksi sebelum dan setelah digunakan
Teknik aseptis harus diikuti saat bekerja dengan mikroorganisme.
Mencuci tangan adalah cara yang sederhana dan efektif untuk mencegah penularan penyakit. Sabun antibakteri dapat memberikan perlindungan tambahan. Manfaat utama mencuci tangan adalah menghilangkan mikroba dari kulit. Gosokan ketika mencuci tangan adalah penting untuk menghapus organisme dari permukaan kulit. Dengan menggunakan tissue untuk mematikan air akan mencegah kontaminasi ulang dengan mikroorganisme. Tangan harus dicuci setiap kali meninggalkan laboratorium.
Peraturan Keamanan Laboratorium Mikrobiologi
- Semua bahan dan pakaian selain yang diperlukan untuk laboratorium harus disimpan jauh dari area kerja.
- Jas lab atau pakaian pelindung lainnya harus dikenakan selama di laboratorium. Pakaian laboratorium tidak boleh dikenakan di luar laboratorium.
- Membersihkan meja laboratorium sebelum dan sesudah digunakan
- Cuci tangan sebelum meninggalkan laboratorium.
- Setiap item yang terkontaminasi dengan bakteri atau cairan tubuh harus dibuang dengan benar. Item disposable(sekali pakai) harus ditempatkan dalam wadah Biohazard.
item reusable item harus ditempatkan di wadah khusus untuk autoclaving sebelum dibersihkan. Benda tajam harus dibuang di wadah khusus.
6 Karena organisme yang digunakan dalam praktikum ini berpotensi patogenik, teknik aseptis harus diperhatikan di sepanjang waktu. Dilarang makan, minum, memakai kosmetik atau merokok. Memipet dengan mulut tidak diperbolehkan. luka goresan harus ditutupi dengan perban. Gunakan sarung tangan sekali pakai.
7 Rambut panjang harus diikat ke belakang sewaktu di laboratorium.
8 Semua kecelakaan, luka, dan setiap gelas atau peralatan yang rusak harus segera dilaporkan kepada instruktur lab.
9 Jauhkan semua bahan yang mudah terbakar dari Bacticinerators. Jangan meninggalkan loop atau jarum inoculating bersandar di Bacticinerator.
10 Mikroskop dan instrumen lainnya harus dirawat seperti yang diarahkan oleh instruktur.
11 Ini adalah tanggung jawab siswa untuk mengetahui lokasi dan penggunaan semua peralatan keselamatan di laboratorium (obat cuci mata, pemadam kebakaran, dll)
12 Orang yang tidak berkepentingan tidak diperbolehkan di laboratorium.
13 Pintu dan jendela harus tetap tertutup sepanjang waktu.
Untuk mendapatkan pengalaman laboratorium terbaik, baca prosedur laboratorium sebelum datang ke kelas. Bawalah catatan yang diperlukan.
Saya telah membaca dan memahami aturan-aturan di atas dan setuju untuk mengikutinya
Tanggal _________________
Nama _________________
Tandatangan_______________
Review- Quiz
Pertanyaan Evaluasi Keselamatan
1. Daftar semua pintu keluar darurat dari laboratorium.
2. Jelaskan bagaimana Anda akan mencapai Keamanan Kampus.
3. Jelaskan bagaimana Anda akan mendapatkan bantuan medis darurat.
4. Apa pakaian pelindung harus dikenakan selama di lab?
5. Apakah yang dimaksud dengan mencegah penularan penyakit secara sederhana dan efektif ?
6. Apa peralatan keselamatan umum yang ditemukan di laboratorium?
7. Di mana lokasi pemadam kebakaran terdekat ?
8. Apa yang Anda butuhkan untuk dibawa ke meja laboratorium ?
9. Bagaimana Anda membuang bahan yang mungkin terkontaminasi dengan bakteri?
10. Bagaimana Anda membuang slide yang patah ?
11.Meja laboratorium Anda baru saja didesinfeksi . Di mana Anda membuang tisu yang anda
gunakan?
12. Setelah mencuci tangan, di mana Anda membuang tisu Anda?
13. Ketika membuang materi yang terkontaminasi untuk digunakan kembali di mana Anda
meletakkannya? Untuk itu Apa yang harus dilakukan sebelum dibuang?
14. Apa yang harus Anda lakukan sebelum Anda meninggalkan lab? Buat Daftar tugas/kegiatan!
Teknik aseptik
Bekerja dengan kultur murni.
Sebuah kultur murni terdiri dari hanya satu jenis mikroorganisme. Kadang-kadang juga digunakan kultur campuran . Dalam kultur campuran ada dua atau lebih organisme yang berbeda karakteristiknya.. Dan mungkin juga terdapat organisme yang tidak diinginkan yang disebut sebagai kontaminan.
Teknik aseptis merupakan metode untuk mencegah masuknya kontaminan ke dalam suatu lingkungan. Ketika mengganti perban luka, teknik aseptik digunakan untuk mencegah kemungkinan infeksi. Ketika bekerja dengan kultur mikroba, teknik aseptik ini digunakan untuk mencegah organisme asing ke dalam kultur/biakan.
Mikroorganisme berada di mana-mana , maka ketika berurusan dengan biakan mikroba adalah sangat penting untuk menangani mereka sedemikian rupa sehingga terjadinya kontaminasi dapat dicegah
Mikroorganisme dapat ditemukan di permukaan dan mengambang di udara sekitar kita, Oleh karena itu pintu dan jendela laboratorium harus tertutup untuk mencegah arus udara yang mungkin membawa organisme kontaminan
Loop dan jarum disterilkan sebelum dan setelah digunakan untuk mencegah organisme yang tidak diinginkan. Media Agar Plate digunakan dengan cara meminimalkan eksposur permukaan terhadap lingkungan. Ketika membuka tutup dari tabung, tutup harus tetap berada di tangan dan tidak boleh diletakkan di meja selama transfer material dari satu tabung ke tabung lainnya.
Teknik-teknik di atas merupakan dasar dari teknik aseptis laboratorium.
Prosedur Laboratorium
Petunjuk Umum
1. Siswa bekerja dalam kelompok.
Bahan / Peralatan
2 Media Agar Darah per siswa atau per kelompok
Spidol
Petunjuk
1. Beri label dengan menulis di sisi petridish, bukan pada tutupnya.
2. Ambil satu Media Agar Plate, beri/tandai dengan garis tengah sedemikian rupa sehingga kita
peroleh dua area. Beri label “kotor” pada satu sisinya, dan sisi yang lain beri label “bersih”
Buka tutup petridish dan sentuhkan secara lembut ujung jari Anda ke agar pada sisi berlabel
"kotor" Ganti tutupnya, Kemudian Cuci tangan atau membersihkan tangan dengan pembersih
tangan dan sentuhkan lembut ujung jari Anda ke agar pada sisi berlabel "bersih"
3. Ambil satu plate agar per siswa dan bagi menjadi empat kuadran. Label kuadran "1", "2", "3",
dan "4".
4. Kenakan sarung tangan dan mencoba menyentuh permukaan sesedikit mungkin.
5. Buka tutup dari plate agar Anda dan sentuhkan dua jari kanan Anda pada media agar dalam
kuadran 1.
6. Ganti tutup pada plate agar dan sentuhkan dua jari tangan kanan Anda ke telapak tangan kiri
siswa lain dalam kelompok Anda.
7. Buka tutup dari plate agar Anda dan sentuhkan dua jari kanan Anda pada media agar dalam
kuadran 2.
8. Ulangi langkah 6 dan 7 dengan dua siswa lain dalam kelompok Anda dan sentuhkan dalam
kuadran 3 dan 4.
9. Hati-hati membuka sarung tangan dan buang dalam wadah Biohazard. Cuci tangan Anda.
10. Ganti tutup dengan label "buka" . masukkan ke dalam inkubator.
11. Pada periode berikutnya lihat adanya pertumbuhan mikroorhganisme, catat hasil pengamatan.
12. Buang semua media agar dalam wadah Biohazard.
Kesimpulan
1. Jelaskan pertumbuhan pada Plate Agar berlabel "Buka".
2. Adakah organisme yang ditemukan di udara? Hasil apa yang mendukung kesimpulan Anda?
3. Catat hasil pada bagan di bawah ini.
Area Plate Hasil
"Kotor"
"Bersih"
4. Apa dampak tidak cuci tangan terhadap mikroorganisme? Bilamana Anda pernah menyentuh
permukaan steril?
5. Catat hasil dari Plate Agar kedua Anda yang diinokulasi dengan sarung tangan pada
bagan di bawah ini.
Kuadran Hasil
1
2
3
4
6. Satu orang dalam kelompok Anda telah diusap mikroorganisme oleh sarung tangan mereka.
. Dari hasil yang diamati Anda dapat menentukan siapa yang memiliki sarung tangan yang
"terkontaminasi" ?
7. Kesimpulan apa yang dapat Anda ambil dari data mengenai di mana mikroba dapat ditemukan
dalam lingkungan?
Mikroskop
Pendahuluan
Mikroorganisme terlalu kecil untuk dilihat dengan mata telanjang sehingga mikroskop harus digunakan untuk memvisualisasikan organisme ini. Menggunakan mikroskop tidaklah sulit meskipun memerlukan beberapa latihan untuk mengembangkan keterampilan yang diperlukan dalam menggunakannya untuk meningkatkan kemampuan kita secara maksimum. Bakteri dan mikroorganisme selular lainnya diukur dalam mikrometer (μ m) atau 1 x 10 pangkat (-6) meter. Virus bahkan lebih kecil dan diukur dalam nanometer (nm) atau 1 x 10 pangkat (-9) m.
Saat membawa mikroskop harus selalu menggunakan kedua tangan. Salah satu tangan memegang lengan mikroskop dan satu harus berada di bawah/menyanggah dasar mikroskop.
Diskusi
Ada beberapa jenis mikroskop tetapi hanya satu yang digunakan dalam laboratorium ini adalah
mikroskop senyawa atau mikroskop medan-terang. Merk mikroskop bervariasi tergantung pada pabrik tetapi semua mikroskop memiliki fitur dasar yang sama.
Fitur Mikrosdop Cahaya :
1. Nosepiece
2. Stage Adjustment Knob
3. Ocular
4. Objectives
5. Arm
6. Base
7. Stage
8. Iris Diaphragm
9. Coarse Adjustment.Knob
11.Fine Adjustment Knob
12,.Light Source
Mikroskop ini dikenal sebagai mikroskop senyawa karena ada dua lensa pembesar mikroskop. Salah satu lensa pembesar di okular dan satu di Obyektif. Masing-masing memberikan kontribusi untuk perbesaran objek, total perbesaran dari setiap set lensa ditentukan dengan mengalikan perbesaran Obyektif dengan perbesaran okular. nosepiece memungkinkan kita untuk mengubah perbesaran mikroskop.
Stage adalah tempat dimana slide diletakkan. Tombol-tombol penyesuaian stage memungkinkan
slide dapat digeser dengan mudah. Cahaya memberikan penerangan untuk obyek. Jumlah cahaya yang mencapai diafragma dapat dibuka atau ditutup dengan menggunakan tuas yang terletak tepat di bawah stage. Perbesaran mikroskop yang semakin tinggi memerlukan pencahayaan yang semaikin terang Terlalu banyak cahaya pada perbesaran rendah menyebabkan obyek kurang jelas dilihat, terutama sesuatu yang kecil seperti sel bakteri.
Tombol-tombol penyesuaian Kasar (makrometer)dan halus (mikrometer) digunakan untuk memperoleh fokus pada spesimen/obyek.
Ada ruang antara objektif dan slide. Ruang ini dikenal sebagai jarak kerja.
Kemampuan untuk melihat mikroorganisme menggunakan mikroskop dibatasi oleh kekuatan resolusi mikroskop. Kekuatan resolusi mikroskop adalah jarak dua benda harus jelas terpisah dan masih dapat dilihat sebagai yang terpisah dan berbeda. Untuk mikroskop cahaya ini resolusinya adalah 0,2 μ m. Objek lebih dekat dari 0,2 μ m tidak akan jelas terlihat. Meningkatkan pembesaran tidak akan membuat objek lebih jelas, hanya lebih besar.
Masing-masing obyektif memiliki obyek perbesaran yang tertulis di obyektif, perbesaran dari okular juga tertulis di okular. Magnifications/pembesaran rendah adalah digunakan untuk memeriksa dengan cepat slide untuk menemukan daerah yang tepat untuk diperiksa. Perbesaran tinggi memungkinkan pemeriksaan objek tertentu pada slide.
Periksa mikroskop dan lengkapi tabel di bawah ini.
Obyektif Perbesaran Obyektif Perbesaran Okular Total Pembesaran
Scanning
Low Power
High Power
Oil Imersi
Ketika Anda melihat melalui okuler Anda akan melihat lingkaran yang bercahaya. Ini dikenal sebagai bidang pandang atau lapangan pandang. Sambil melihat melalui mikroskop ubahlah tuas diafragma dan perhatikan bagaimana terjadi perubahan pencahayaan. Ketika Anda memindahkan obyek untuk membuat peningkatan perbesaran,Anda akan melihat bagian kecil dari slide. Pastikan Anda memindahkan objek Anda ke tengah lapangan pandang sebelum berpindah ke tujuan berikutnya.
Prosedur mendapatkan Fokus
1. Ambil sebuah slide.
2. Gunakan tombol penyesuaian kasar (makrometer) untuk mendapatkan jarak kerja maksimum
3. Tempatkan slide di stage. Slide harus sesuai dengan pemegang slide dan jangan ditempatkan di
bawah pemegang slide. Tahap penyesuaian menggunakan tombol penggeser untuk menggeser
slide
4. Putar obyektif daya rendah (10x)
5. Gunakan tombol penyesuaian kasar(makrometer) untuk mendapatkan jarak kerja minimum.
Latihlah kebiasaan melihat dan melakukan proses ini untuk memastikan supaya objektif tidak menyentuh slide dan mematahkannya.
6. Lihat melalui okular. Sesuaikan cahaya dengan diafragma , gunakan tuas diafragma jika diperlukan. Perlahan-lahan putar kenop penyesuaian kasar (makrometer) sampai sesuatu bayangan datang ke fokus. Gunakan tombol penyesuaian halus (mikrometer) untuk mempertajam fokus.
7. Gunakan tombol penyesuaian penggeser untuk menemukan area obyek yang Anda inginkan . Pindahkan slide sampai objek yang diperiksa berada di tengah lapangan pandang.
8. Putar Obyektif daya tinggi . Gunakan tombol untuk penyesuaian halus (mikrometer) untuk mempertajam fokus. Jangan gunakan tombol penyesuaian kasar (makrometer). Atur cahaya
menggunakan tuas diafragma jika perlu.
9. Putar objek daya tinggi (100 X). Tuangi setetes minyak imersi pada slide, kemudian putar objektif dengan tepat dan benar sedemikian rupa sehingga harus tenggelam dalam minyak immersi pada slide. Gunakan tombol penyesuaian untuk mempertajam fokus. Sesuaikan cahaya menggunakan tuas diafragma jika diperlukan.
10. Ketika selesai melihat slide gunakan tombol penyesuaian kasar untuk memaksimalkan jarak kerja dan angkat slide dari stage jika Anda ingin melihat slide lain, atau proses telah selesai.
Jika Anda telah selesai dengan mikroskop bersihkan mikroskop dan kembalikan ke tempat penyimpanan.
Prosedur untuk Pembersihan sebuah Microscope
1. Matikan lampu dan cabut kabelnya.
2. Gunakan tombol penyesuaian kasar untuk mendapatkan jarak kerja maksimum dan hilangkan
slide dari stage.
3. Gunakan kertas lensa untuk membersihkan semua lensa, dimulai dengan pertama-okular,
lalu lensa obyektif pembesaran rendah sampai tinggi.
4. bersihkan minyak yang mengotori stage menggunakan Kimwipes atau tissue
5. Putar lensa obyektif ke tempatnya. Gunakan tombol untuk penyesuaian kasar (makrometer)
untuk memperoleh jarak kerja minimum
6. Kembalikan mikroskop pada tempat penyimpanan yang sesuai.
Review Pertanyaan
Label gambar mikroskop.
Definisikan :
Lapangan pandang
Jarak kerja
Katakan fungsi dari masing-masing berikut.
Makrometer
Mikrometer
Diafragma
Unit pengukuran apa yang digunakan untuk mengukur bakteri?
Bagaimana Anda menentukan perbesaran total satu set lensa?
Jelaskan proses untuk mene mukan fokus pada slide.
Jelaskan bagaimana benar bersih mikroskop.
Smear
Pendahuluan
Pemeriksaan mikroskopis mikroorganisme adalah tehnik identifikasi yang sangat berharga. Untuk melihat mikroba perlu untuk mempersiapkan slide dari organisme.
Slide atau Preparat mikroskopis dapat bersifat sediaan basah atau sediaan yang dicat.
Wet mounts (sediaan basah) adalah menempatkan sel-sel dalam setetes air, menutupnya dengan coverslip dan melihat materi di bawah mikroskop. Dalam mikrobiologi, sebagian besar organisme adalah bakteri yang kecil dan sulit dilihat jika tanpa dicat. Untuk dapat melihat satu sel per lapangan pandang minyak immersi, harus ada sedikitnya 500.000 sel per mililiter.
Membuat sediaan /slide adalah proses mengambil kuman hidup, disuspensi/ditambah air, diusapkan dan ditipiskan di atas kaca obyek, dikeringkan, difiksasi dengan panas api, kemudian dicat. Jumlah sel yang akan dibuat sediaan harus diperhitungkan, karena bila terlalu sedikit organisme maka akan sulit untuk menemukan mereka, dan bila terlalu banyak organisme akan menyulitkan kita untuk melihat sel-sel individual sehingga sulit dalam menentukan morfologi atau bentuk.
Prosedur Laboratorium
Petunjuk Umum
1. Siswa bekerja secara individu.
2. Untuk mensterilkan suatu loop atau jarum inoculating memasukkan loop atau jarum ke dalam Bacticinerator
dan perhatikan. Harus menyala merah selama tiga detik. Jika tida ada Bacticinerator, gunakan bunzen atau
nyala api lampu spirtus untuk membakar/mensterilkan loop/ose.Loop dan jarum tidak boleh disandarkan pada
Bacticinerator. Loop atau jarum harus didinginkan sebelum menyentuh koloni bakteri.
3. Buka tutup dari botol atau tabung secara aseptik, pegang tutupnya dengan jari kelingking . Jangan
meletakkan tutup di atas meja tetapi tetap di tangan Anda sambil mengambil/memindahkan materi dari botol
atau tabung. Tutup kembali botol atau tabung dengan memutar botol atau tabung, kencangkan tutupnya.
Bahan / Peralatan
Gelas bersih slide
Biakan murni dari Staphylococcus aureus dan E. coli
Inoculating loop
Bacticinerator
Laboratorium marker
Petunjuk
1. Kaca slide harus relatif bersih dan bebas lemak. Slide yang tidak tampak bersih dapat dicuci sabun dan air dan
dikeringkan dengan tissu. Label slide di salah satu ujung.
2. sterilkan inoculating loop. Secara Aseptik buka tutup tabung berisi air dan ambil dengan memakai loopful air dari
tabung. Tutup kembali tabung..
3. Ketukkan loopful yang membawa air tersebut ke pusat salah satu slide yang berlabel
4. sterilkan loop.
5. Ambil biakan murni dari media agar slant . Secara Aseptik buka tutupnya. Masukkan loop yang steril ke dalam tabung
secara berhati-hati supaya tidak menyentuh bibir tabung. Sentuhkan loop ke permukaan agar. JANGAN menggores atau
menggali ke dalam agar. Keluarkan loop dan tutup kembali tabung.
6. Campur kuman yang menempel pada loop dengan setetes air tepat pada pusat slide berlabel Ratakan pada permukaan
slide campuran antara bakteri dan air. Semakin tipis sediaan itu akan semakin cepat kering.
7. Biarkan smear kering di udara
8. Panaskan slide dengan cara melewatkan di bagian atas Bacticinerator sebanyak 10 X
9. Slide siap untuk dicat. Atau mungkin disimpan sampai waktu yang dibutuhkan.
10. Ulangi langkah 2-8 untuk membuat dua sediaan Staphylococcus aureus dan dua sediaan E. coli. Simpan slide slide
dalam kotak untuk digunakan di masa depan
Direct Smear
Jika spesimen diambil dengan menggunakan Jika spesimen berupa cairan/suspensi, teteskan
swab lidi kapas, gelindingkan swab di atas atau ambil dengan loop/ose steril, tipiskan,lalu
object glass yang bersih., biarkan mengering. biarkan mengering.
.
Untuk kedua hal tersebut di atas, specimen difiksasi dengan melewatkan obyek glass /slide diatas api (flaming) 2 sampai 3 kali.
Review Pertanyaan Smear
1. Jelaskan dua persiapan yang dapat digunakan untuk mengamati mikroorganisme.
2. Apa tujuan fiksasi panas?
3. Garis besar prosedur untuk membuat sediaan?
4. Mengapa slide yang digunakan dalam membuat smear harus bebas lemak ?
5. Apakah perlunya menggunakan air steril saat membuat sediaan? Mengapa atau mengapa tidak?
6. Jelaskan dua alasan untuk tidak menyangga inoculating loop dan jarum di Bacticinerator selama
sterilisasi.
7. Berapa lama waktu yang diperlukan untuk mensterilkan suatu inoculating loop atau jarum?
8. Ketika membuka tutup tabung menggunakan teknik aseptis, apa yang Anda lakukan dengan
tutupnya?
Pewarnaan
Pendahuluan
Bakteri memiliki indek bias hampir sama dengan indeks bias air. Ini berarti ketika Anda mencoba melihat dengan menggunakan mikroskop mereka terlihat sebagai samar-samar, abu-abu dan sulit untuk dilihat. Sel yang diwarnai membuat mereka lebih mudah untuk dilihat.
Pewarnaan sederhana hanya menggunakan satu pewarna . Pewarnaan diferensial menggunakan dua atau lebih pewarna dan dapat mengkategorikan kelompok sel
Kedua teknik pewarnaan tersebut memungkinkan dalam deteksi morfologi sel, atau bentuk, tapi pewarnaan diferensial memberikan informasi tambahan tentang sel. Pewarnaan diferensial yang umum digunakan dalam mikrobiologi adalah Pewarnaan Gram.
Bakteri mempunyai tiga bentuk dasar atau morfologi . Sel bulat dikenal sebagai cocci, sel-sel bacilli berbentuk batang, dan sel-sel berbentuk spirilla yang spiral.
Prinsip
Pewarnaan Sederhana : Cat yang sederhana terdiri dari satu pewarna. Cairan melekat pada sel dan mewarnai dinding sel sehingga memudahkan untuk dilihat.
Gram Stain: Gram stain adalah pewarnaan diferensial . Empat reagen yang berbeda digunakan dan hasilnya didasarkan pada perbedaan dalam dinding sel bakteri. Beberapa bakteri memiliki dinding sel yang relatif tebal terutama terdiri dari karbohidrat yang dikenal sebagai peptidoglikan. Sel-sel bakteri lainnya berdinding sel lebih tipis terdiri dari peptidoglikan dan lipopolysaccharides. Peptidoglikan tidak larut dalam non polar atau pelarut organik seperti alkohol atau aseton, tetapi lipopolysaccharides nonpolar akan larut dalam pelarut organik nonpolar.
Kristal violet bertindak sebagai cat utama. Cat ini juga dapat digunakan sebagai pewarna sederhana karena dapat mewarnai dinding sel bakteri apapun. Gram's iodine bertindak sebagai mordant. Reagen ini bereaksi dengan kristal violet dan menghasilkan komplek kristal besar yang tidak mudah tercuci keluar dari sel. Pada titik ini dalam proses pewarnaan semua sel akan berwarna sama. Perbedaan dalam struktur dinding sel dapat dilihat setelah penggunaan larutan aseton dan alkohol sebagai decolorizer. . Yang tidak terpengaruh oleh decolorizer adalah dinding sel yang terutama terdiri dari peptidoglikan tetapi mereka yang mengandung komponen lipid akan larut dan menimbulkan lubang-lubang besar dalam dinding sel akibat hilangnya lipid oleh aseton dan alkohol. Lubang besar ini akan memungkinkan kompleks kristal yodium ungu- tercuci dan lepas keluar dari sel, menyebabkan sel menjadi tidak berwarna. Sebuah counterstain, safranin, yang dituangkan ke sediaan akan mewarnai sel-sel tidak berwarna tadi.
Sel-sel yang mempertahankan Cat utama akan berwarna biru atau ungu dan dikenal sebagai Gram positif. Sel-sel yang dapat diwarnai dengan counterstain akan tampak merah muda atau merah dan
dikenal sebagai Gram negatif. Lypopolysaccharide dari sel Gram negatif juga bertindak sebagai endotoksin. Endotoksin inilah yang dilepaskan ketika sel mati dan bertanggung jawab terhadap terjadinya demam dan perasaan umum yang tidak enak yang menyertai infeksi oleh Gram negatif.
Membuat laporan pewarnaan Gram :
Amati dengan cermat bentuk sel (bulat atau batang), warna Ungu atau merah) dan bila perlu susunannya (berderet atau bergerombol atau diplo). Morfologi sel yang bulat, ungu (biru), maka sel-sel akan dilaporkan sebagai Cocci Gram Positif, dan bila berbentuk batang, ungu (biru), sel-sel akan dilaporkan sebagai Basil Gram positif
Ada singkatan standar yang dapat digunakan untuk laporan ini.
GPC Gram positif cocci
GNC Gram negatif cocci
GPB Gram positif basil
GNB Gram negatif basil
Bakteri Berbentuk spiral tidak bisa diwarnai dengan Pewarnaan Gram dan biasanya dilihat dengan menggunakan mikroskop medan-gelap. Tidak ada standar Pewarnaan Gram untuk spirilla.
Prosedur Pewarnaan Sederhana
Bahan
Sediaan kuman
Methylene biru, kristal violet, atau Safranin untuk digunakan sebagai pewarna sederhana
Kertas tissu atau kertas saring
Alat
Mikroskop
Baccinerator
Loop/Ose
1. Tutup label pada slide dengan selotip.
2. Letakkan slide pada rak dan tuangi slide dengan pewarna selama 1 menit
3. Bilas slide dengan air keran, miringkan slide , biarkan sediaan mengering, atau
4. Tempatkan selembar kertas atau kertas saring di meja laboratorium dan letakkan slide
diatasnya. Lipat kertas di atas slide dan dengan lembut hilangkan air dari slide
5. Memeriksa sediaan di bawah mikroskop cahaya dan catat hasil
Morfoligi sel bakteri
Cocci Basil Spirilla
Tidak ada komentar:
Posting Komentar